鼻咽癌组织病理学诊断的体会

我国南方地区，特别是珠江三角洲地区，是鼻咽癌的高发区。近十多年来，由于分子病理学的发展，病理医师对鼻咽癌组织病理学的认识和诊断水平有了相应的提高。作者从事鼻咽癌组织病理学诊断研究工作多年，愿将组织病理学诊断中的点滴体会在此与同行分享。

鼻咽部癌(nasopharyngeal cancer)是指发生在鼻咽部的恶性上皮性肿瘤。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是主要的一类鼻咽部癌。鼻咽部癌中还有乳头状腺癌和涎腺型癌等。关于鼻咽癌的定义，学者们所用词语不完全相同，反映了他们对其理解存在差异。我们基本上同意2005年(WHO头颈肿瘤病理学和遗传学》(简称2005年WHO分类)书中的观点。定义中的第一层意思是癌细胞必须起源于鼻咽黏膜的被覆上皮；癌细胞形态学与鼻咽未分化癌(CK7阴性)十分相似的分化极差的涎腺型腺癌(CK7阳性)不属于鼻咽癌，因为后者来源于小涎腺。另一方面，起源于鼻咽黏膜被覆上皮的癌不单是鼻咽癌，鼻咽乳头状腺癌也起源于被覆上皮。定义的第二层意思是癌细胞在光镜或电镜下有鳞状上皮分化的证据。如果在光镜下仔细观察，在相当多的HE切片中，会有鳞状上皮分化特征明显的癌细胞，至少可以见到呈原始鳞状上皮分化的癌细胞，即细胞界限较清楚，不是合体状，胞质星轻度嗜酸性。所以，多数鼻咽癌在光镜下就可以观察到鳞状上皮分化。当然，确实有一部分鼻咽未分化癌，特别是淋巴上皮瘤样变异型(1ymphoepitheliomalike variant)，光镜下很难找到原始鳞状上皮分化的癌细胞，需要电镜观察。我们曾在电镜下观察了100多例淋巴上皮瘤样变异型鼻咽未分化癌，都能见到张力丝束和桥粒。也曾观察过几批鼻咽非角化性癌的切片，约1／10的HE切片中可见少许癌细胞内有淀粉样小球。Prathap等也在12％(54／434)的鼻咽癌中见到淀粉样小球。这种淀粉样小球体积略小于癌细胞，也可见于邻近癌巢的间质中，呈刚果红染色阳性。Condo等在冷冻切片中证实这种淀粉样小球可以与抗细胞角蛋白抗体起反应，认为是张力丝束变性所致。因此，在鼻咽非角化性癌中见到淀粉样小球的事实进一步提示，鼻咽癌是向鳞状上皮分化的一类癌。是否鼻咽癌细胞完全向鳞状上皮分化呢？Shanmugaratnam和Sobin指出鼻咽癌并无产生黏液或腺性分化的证据。但是，根据我们的观察，确有少数鼻咽癌组织中存在少量产生黏液的癌细胞或流产型腺泡的结构。2005年WHO分类书中在非角化性癌组织病理学一节中也提到该现象。我们近期曾见到2例鼻咽未分化癌中包含数量较多胞质内含黏液的EBER(EB病毒编码的早期RNAs)核阳性的癌细胞。如果设想鼻咽癌是来源于黏膜被覆上皮中具有多向分化潜能的储备细胞，那就不难理解。已恶变的储备细胞虽然大多数主要向鳞状上皮方向分化，少数也可向黏液细胞分化。如何使2005年WHO鼻咽癌定义中的用词更加完善，能体现上述内容，值得探讨。

鼻咽癌患者治疗前，必须通过活检确诊。有时EB病毒血清学抗体水平或I临床征候十分疑似鼻咽癌，而内窥镜下肿物不明显，不知从何处取材时，可首先考虑在耳咽管紧靠咽鼓管圆枕的上方和后部的咽隐窝处取材，因为大多数鼻咽癌原发于此。我们观察了1998年42 018例3059岁中山市人群鼻咽癌普查中所取的活检以及2009年持续至今的中山市人群鼻咽癌普查活检，发现的早期鼻咽癌病变多位于咽隐窝处。当然，如能再在侧壁和顶后壁多处取材，则鼻咽癌漏诊率会更低。鼻咽活检组织一般较小，切片时不要浪费；留下一定量的组织，以便能做其他染色和(或)抽提DNA，从事分子病理学检测，配合临床为患者提供个体化治疗。

鼻咽癌的组织学分型，学者们各有各的看法。1978年，以Shanmugaramam教授为首的专家组出版了第一版WHO鼻咽癌组织学分型的意见。将鼻咽癌分为三型，即鳞状细胞癌、非角化性癌和未分化癌。WHO西太平洋区总部于1981年12月在广州召开了鼻咽癌专题讨论会。与会专家认为，因为生物学行为类同，未分化癌应包括在非角化性癌中。这一论点随后体现在1991年第二版{WHO上呼吸道和耳肿瘤的组织学分型》中。该书将鼻咽癌分为鳞状细胞癌和非角化性癌两型，而非角化性癌又细分为分化性和未分化性非角化性癌。对于非角化性癌是否需要再细分，专家组会议中曾有不同意见。2005年WHO分类是WHO关于鼻咽癌分型的第三版，将鼻咽癌分为非角化性癌(nonkeratinizing carcinoma．ICD．O 8072／3)、角化性鳞状细胞癌(keratinizing squamous cell carcinoma，ICD-O 8071／3)和基底样鳞状细胞癌(basaloid 8quamou8 cell carcinoma，ICD一08083／3)3)三型。本文作者基本同意该分型意见。当然，随着鼻咽癌组织病理学诊断研究的深入，将来势必有改进。基底样鳞状细胞癌是新加入的一型，即同时具有鳞状细胞和基底细胞样分化两种成分癌的结构。非角化性癌和角化性鳞状细胞癌两者都是有向鳞状上皮方向分化的一类癌，只是鳞状上皮分化的程度高低不同，统称为鳞状细胞癌即可，还有必要分为两个亚型吗？作者同意2005年WHO分类.中的意见，认为有必要。因为鼻咽癌的流行病学显示，低发区主要是角化性鳞状细胞癌，而高发区则主要是非角化性癌。另外，作者所参与的研究表明，寄居在角化性鳞状细胞癌中尚未角化的癌细胞中的EB病毒与寄居在非角化性癌细胞中的一样，均为潜伏性感染，呈EBER核阳性；而寄居在角化性鳞状细胞癌角化珠中角化癌细胞的EB病毒则常是溶解性感染，呈EBER核阴性。但一定要掌握1992年《WHO上呼吸道和耳肿瘤组织学分型》中将切片中绝大多数癌细胞具有细胞间桥和(或)角化(包括角化细胞或角化上皮珠形成)，而不是上文所述将只限于原始鳞状分化者，诊断为角化性鳞状细胞癌。当然，角化性鳞状细胞癌还可细分为高、中和低三个分化程度。有没有必要将非角化性癌再分为分化性和未分化性？根据作者曾参与过的有关研究表明，这两亚型肿瘤的临床表现、生物学行为、疗效和预后无明显差异，因此在病理报告中不一定要标明。在鼻咽癌活检切片中，可以见到明确的主要是分化性非角化性癌或明确的主要是未分化性非角化性癌，但在相当一部分病例中，两亚型的形态学同时并存，难以明确何者占优势。在这种情况下，可以诊断为鼻咽非角化性癌或具有分化性和未分化性两种成分的鼻咽非角化性癌，不必勉强分亚型。作者在近年来所见的非角化性癌中，大多数为未分化性，或称鼻咽型未分化癌。这情况似与20世纪50、60年代所见者有所差异，那时分化性非角化性癌似乎要多一些；可惜已无确切数据留下。在Shanmugaratnarn等于1979年所报道的新加坡363例鼻咽癌中，分化型与未分化型之比为1．02：1．00(178／172)。是当时的分型标准与现在不一样，还是年代不同两亚型的比例确有变动？可以收集不同时期的标本作比较性研究。经典的未分化性非角化性癌是由合体状、细胞界限不清的、体积较大的、含泡状核和明显核仁及胞质嗜双染或嗜酸染的癌细胞组成。癌细胞常聚集成群或重叠在一起。癌细胞形成巢状、岛状或条索状，与不等量的淋巴细胞和浆细胞混杂在一起。这就是过去称之为淋巴上皮癌或泡状核细胞癌。在癌组织的切片中，除了上述癌细胞的形态学表现外，当然仍然可以找到少量上文所述原始鳞状上皮分化的癌细胞。作者认为，可将具有这种形态学的癌称为鼻咽淋巴上皮变异型未分化性非角化性癌，在这种淋巴上皮变异型未分化性非角化性癌的组织中，不～定要求全部癌细胞核均呈泡状，有些癌细胞核可以富含染色质，不呈泡状。但是，如果大多数癌细胞核不呈泡状，且癌细胞问无多量淋巴细胞和浆细胞掺杂在一起，则不宜称为淋巴上皮变异型。在淋巴上皮变异型未分化性非角化性癌中，每可见到散在的或少量聚集成小堆的皱缩的梭形癌细胞，核深染而模糊，胞质呈致密的双染或嗜酸染。这些细胞CK(AEl／AE3)阳性、EBER阳性，可能是变性的癌细胞。如果在癌巢边缘见到向周围浸润的梭形癌细胞，EBER阳性、CK斑点状阳性或阴性、波形蛋白阳性或阴性，则可能是失去癌细胞之间的连接所致，是癌细胞呈上皮-间质转变(epithelialmesenehymat transition，EMT)的表观。我们见有些淋巴结的转移性鼻咽癌中，许多癌细胞失去了CK(AEl／AE3)的表达，也可能与EMT有关。利用鼻咽癌活检组织探讨癌细胞的EMT是目前鼻咽癌组织病理学研究中的新课题。在未分化性非角化性癌的切片中，见到少量明显的有细胞间桥的角化性癌细胞或梭形鳞状细胞，甚至出现小堆角化上皮珠亦不足为奇，仍可诊断为未分化癌。在未分化性非角化性癌中的切片中，有时还可见到上文所述少量黏液性癌细胞和(或)流产型腺泡结构。作者认为未分化癌细胞来源于具多潜能分化的被覆上皮细胞，虽然其主流是向鳞状上皮方向分化，个别或少数癌细胞可以变异地向黏液细胞或柱状上皮细胞分化。我们曾见到l例含较多黏液性癌细胞的鼻咽未分化癌，还有2例未分化癌和腺癌并存的病例。文献中亦有报道。这两个癌克隆都来源于具多潜能分化的被覆上皮细胞，一个向鳞状上皮方向分化，另一个向柱状上皮细胞分化形成腺性结构。与未分化性癌比较，分化性癌细胞一般要小一些，细胞界限较清楚，有时可见模糊的细胞间桥，核质比低，核内可含较丰富的染色质，核仁一般不明显。有时癌细胞呈含糖原的透明细胞。癌细胞排列成分层结构，癌巢最外层细胞每形成铺路石样，似膀胱移行细胞癌那样的丛状生长。作者认为可将具有这种形态学的癌称为移行细胞变异型分化性非角化性癌。还有一种分化性非角化性癌，绝大多数癌细胞呈梭形，细胞界限较清楚，但无明确的细胞间桥，可以称为梭形细胞变异型。我们复习了广州地区2800例新发的鼻咽癌，仅见3例梭形细胞变异型分化性非角化性癌。在鼻咽非角化性癌中，或多或少可见一些梭形癌细胞，核可呈含明显核仁的泡状或呈皱缩而深染，甚至可见小堆梭形癌细胞呈旋涡状的聚集，不要将其诊断为梭形细胞变异型分化性非角化性癌。在鼻咽分化性非角化性癌中，可见到小部分癌细胞有明显的细胞间桥和(或)角化细胞，甚至个别角化珠，不要诊断为角化性鳞状细胞癌。

鼻咽癌有亚型，亚型中又可以有变异型。即使在同一患者，取自鼻咽不同部位或取自患者治疗前不同时期的活检标本中，癌细胞的形态都不会完全一样。作者曾见到在大片典型的淋巴上皮样未分化性非角化性癌细胞中，出现明确的角化上皮珠；亦曾见到在大片典型的淋巴上皮样未分化性非角化性癌细胞中，出现具有清晰细胞间桥、胞质嗜酸性的鳞状细胞。有时，鼻咽未分化性非角化性癌细胞几乎全部呈巢状结构，与间质分界清晰，即呈典型的Regaud型生长方式。有时，鼻咽未分化性非角化性癌细胞与浸润的淋巴细胞和浆细胞互相混杂在一起，与间质无明确界限，即呈Schmincke型生长方式。但是，在多数鼻咽非角化性癌中，经常是Regaud型和Schmincke型两种生长方式同时并存。癌细胞间质反应各例也不一样，有的富含新生小血管，有的富含淋巴细胞和浆细胞，有的富含嗜酸性细胞，有的是促纤维增生性间质。有时，在既无溃疡又无坏死的非角化性癌细胞问却可见到难以解释的中性白细胞浸润。间质中的淋巴细胞以及滤泡树突状细胞等辅助细胞数量可多可少，是机体对癌细胞反应的表现。综合起来说，即使是同一例鼻咽非角化性癌，其组织细胞学表现也或多或少具有异型性。近年来，我们见到1000多例曾做EBER原位杂交的治疗前鼻咽癌活检切片，绝大多数病例的癌细胞核呈EBER阳性。但确有两例明确的非角化性癌，癌细胞EBER阴性。抽提这2例活检组织的DNA，做了EB病毒w片段和EBNAl片段的PCR检测，亦呈阴性结果。这说明，即使在鼻咽癌高发区，也存在无EB病毒感染的鼻咽非角化性癌。鼻咽癌亚型不同，所感染的EB病毒序列变异不同。张敏等报道85.4％的鼻咽非角化性癌所感染的EB病毒为30 bp缺失型潜伏膜蛋白(LMP)1，而只有16％的角化性鳞状细胞癌所感染的EB病毒为30 bp缺失型LMPI。即使均为鼻咽非角化性癌，所感染的EB病毒序列变异亦可呈多样性。林素暇等报道所感染的EB病毒N端与c端的变异就有四种组合，即wt-Xho I／wt-LMPl(6．3％)，wt-Xho I和Xho Iloss／delLMPl(6．3％)。wt．Xho I／del．LMPl(7．9％)以及Xho I．10ss／del．LMPl(79．5％)。韩安家等报道有两例鼻咽非角化性癌，即在同一例中所感染的EB病毒LMPI c端出现不同序列。也就是说，有的癌细胞感染wtXho I，有的癌细胞感染XhoI．10ss。作者所参与的多次有关研究显示，鼻咽未分化癌活检中EB病毒编码LMPl蛋白表达的病例数波动在30％至60％之间。正常鼻咽黏膜被覆上皮的储备细胞或称基底细胞呈p63阳性，显示其具有向多层上皮细胞分化潜能的细胞，这符合Senoo等有关p63的研究结论。作者在95％以上的鼻咽未分化性非角化性癌中见到大多数癌细胞呈p63核阳性；且认为p63免疫组织化学染色有助于辅助未分化性非角化性癌的诊断；因为p63的高表达可阻断p53介导的失活功能以及癌细胞的凋亡B。但是，确有少数未分化性非角化性癌病例的大多数癌细胞呈p63核阴性。正如Pellegrini等研究显示，大多数未分化性非角化性癌是p63阳性的同质性癌细胞克隆，而少数未分化性非角化性癌则出现了p63阴性的癌细胞旁克隆。许多肿瘤的发生与抑癌基因p53突变有关，可是鼻咽非角化性癌却并非如此。作者仅在少数鼻咽非角化性癌中检测到p53基因第59外显子这一段序列中有突变；但核内p53蛋白的过表达，却可在相当一部分鼻咽非角化性癌中见到。无论有无p53蛋白过表达，所有鼻咽非角化性癌中都可见到极少几个MDM2阳性的癌细胞。没有发现p53蛋白过表达与其转导通路中相关的MDM2蛋白表达有关联性。大约30％的未分化性非角化性癌病例中有部分癌细胞呈CD30(Ber-H2)阳性，大约10％病例中有部分癌细胞呈CDll7(c-kit)阳性，这在文献中已有报道。Chen等报道有32.4％的鼻咽癌中有bel-2的过表达且与癌细胞的转移有关。Ma报道78例鼻咽非角化性癌中73例癌细胞呈表皮生长因子受体(EGFR)阳性。Hui等报道90例鼻咽非角化性癌中54例(60％)呈血管内皮生长因子(VEGF)过表达。Lai等报道54.7％鼻咽癌病例的癌细胞表达涉及细胞凋亡的cyclinD1。Qian等报道晚期鼻咽癌细胞常表达Met原癌基因蛋白，与放疗后预后有关。总之，鼻咽癌细胞不但其形态可以异型性(heteromorphic)，其免疫表型以及分子遗传学也常常呈异质性(heterogeneous)。我们在研究鼻咽癌组织病理学时，不但要研究其多形性，还要研究其异质性。根据鼻咽癌细胞的异质性，探讨对鼻咽癌患者的个体化治疗，正是我们病理学工作者当前的任务。我们不仅在病理报告中指出是什么形态？哪种亚型？还要检测分子遗传学方面有何改变。因为鼻咽癌的治疗目前已从单纯放疗向放疗加化疗以及手术的综合性治疗转变。化疗时该采用何种有针对性的药物需要分子遗传学方面的信息。鼻咽癌细胞异质性的研究也为探讨癌细胞发生发展机制提供线索。所以，组织病理学不单是形态学观察，也包括分子病理学特征。

首先，要了解患者的年龄和病情。作者曾见到几例传染性单核细胞增多症患者的鼻咽活检，曾被考虑过是否为鼻咽癌。但这几位患者的年龄均小于20岁，有轻度发热、肝、脾和淋巴结肿大。经加染CK(AEl／AE3)和白细胞共同抗原(LCA)免疫组织化学后就否定了鼻咽癌的可能，虽然鼻咽癌和传染性单核细胞增多症切片中均可见EBER阳性细胞。虽然在传染性单核细胞增多症中所见EBER阳性细胞大多是B淋巴细胞，但确实可以有少数T淋巴细胞也可感染EB病毒，呈EBER阳性。另外，还要了解患者血清中抗EB病毒抗体水平。如果患者血清中有两种以上的抗EB病毒抗体水平高于临界值。或是EB病毒DNA拷贝数高，而切片中见隐窝被覆上皮呈或多或少异型性增生，宜加做EBER原位杂交、p63、CK(AEI／AE3)和CK7，如果异型性增生细胞呈核EBER和p63阳性以及胞质CK(AEl／AE3)阳性，CK7阴性，则可以诊断为早期癌变。作者在近年来人群鼻咽癌普查中曾见到几例这种情况。有些非角化性癌的间质中可见上皮样肉芽肿反应，容易误认为是结核。前者无干酪样坏死，在其旁每可找到胞质CK(AEl／AE3)阳性和胞核EBER阳性的癌细胞；而后者采用抗酸染色或PCR检测，每可证实有结核菌感染。鼻咽部可以发生鼻型NK／T细胞淋巴瘤，该瘤的被覆上皮细胞可呈假上皮瘤样增生反应，不要误诊为鼻咽癌。鼻咽淋巴组织增生时，有时可见无明显套区的淋巴滤泡生发中心，很像一个小癌巢，因为其中含有泡状核的中心母细胞。但是，淋巴滤泡生发中心中还混杂有中心细胞和巨噬细胞。如果加染CK(AEl／AE3)和LCA，两者就很容易区别了。鼻咽淋巴组织增生时，有时可见较多的反应性免疫母细胞，易与未分化癌细胞混淆，但它们不呈合体状，CK(AEI／AE3)阴性和EBER核阴性。有时，斜切的异型性增生隐窝上皮细胞也易与未分化癌细胞混淆，加做EBER原位杂交，有助于鉴别。异型性增生上皮细胞与鼻咽癌细胞，虽然两者CK(AEl／AE3)均为阳性，但前者CK7阳性、EBER核阴性而后者cK7阴性、EBER核阳性。上文所述鼻咽淋巴上皮变异型未分化性非角化性癌中的大泡状核癌细胞在形态方面很像霍奇金淋巴瘤的Reed-stemberg细胞或陷窝细胞，EBER核阳性，甚至CD30也可阳性，但CK(AEl／AE3)阳性，特别是CK5／6阳性和CK7阴性，有助于确诊为癌细胞。在取自放疗后的鼻咽活检组织中，如果在被覆上皮中见到少数散在的核质比正常而核却深染甚至畸形的细胞，是放射线导致的细胞退变，一年内会消失，不要诊断为残留的癌细胞。如做EBER原位杂交，则放疗导致退变的细胞为阴性，而残留的癌细胞为阳性。