蛋白质组学在自身免疫性疾病中的应用

蛋白质组学在自身免疫性疾病中的应用

目前全世界大约有3%的人罹患自身免疫性疾病。由于一些自身免疫性疾病的发病机制至今仍不十分清楚，因而疾病的诊断和分型仍然基于实验室检测结果与临床症状进行综合分析判断。蛋白质组学的发展完善为自身免疫性疾病的研究带来了新的思维方式并开拓了新的研究领域，已被证明是探索和寻找自身免疫性疾病新的生物标志物的有力工具。

1蛋白质组学

1994年，澳大利亚科学家Wilkins和Willian首次提出蛋白质组的概念，蛋白质组学主要是系统性研究一种基因组，一种生物，或者一种细胞（组织）所表达的全套蛋白质。蛋白质是组织、细胞功能的主要执行者，是基因通往细胞功能的桥梁。故而蛋白质组学能更真实、更直接地体现生命现象的本质，能更深入地揭示各种复杂生命活动的机制。

2 蛋白质组学在自身免疫性疾病中的应用

2.1 蛋白质组学探讨自身免疫性疾病的发病机制

自身免疫性疾病是机体对自身成分发生免疫应答而导致的疾病状态，可分为器官特异性自身免疫性疾病和全身性自身免疫性疾病。器官特异性自身免疫性疾病患者的病变局限于某一特定的器官，由对器官特异性抗原的免疫应答引起。全身性自身免疫性疾病，又称系统性自身免疫性疾病，其病变可见于多种器官和组织。自身抗体和（或）自身反应性T淋巴细胞介导的对自身成分发生的获得性免疫应答是自身免疫性疾病发生的原因。然而，在这些器官特异性和系统性自身免疫性疾病中，大多数疾病的发病机制还不十分清楚。蛋白质组学的出现，为探讨自身免疫性疾病的发病机制提供了有力的工具。Ⅰ型糖尿病是一种器官特异性自身免疫性疾病，在遗传易感性的基础上，绝大部分胰岛β细胞被自身免疫反应所破坏，从而引起胰岛素分泌不足与血糖升高，Ⅰ型糖尿病病因不明，发病机理较为复杂，可能与多种因素有关。Purohit等通过SELDI-TOF技术检测Ⅰ型糖尿病患者和抗胰岛细胞自身抗体阴性的健康者的血清样本，利用单变量和多变量分析，试图寻找Ⅰ型糖尿病的标志物，共发现146个具有统计学差异的蛋白峰，为进一步筛选Ⅰ型糖尿病的诊断生物标志物提供了有力的基础。复发性多发软骨炎（RP）是一种全身性（系统性）炎症疾病。发病机制不完全清楚，有学者认为软骨相关成分的自身免疫可能与疾病发病有关。Tanaka Y等人应用2-DE免疫印迹联合MS的方法，用细胞提取蛋白作为抗原来源，检测到15种自身抗原，并进一步鉴定了其中的5种，这5种自身抗原相对自身抗体出现的频率依次是微管素α/6为91%、波形蛋白为46%、α-烯醇化酶为36%、钙网织蛋白为82%、colligin-1/-2为36%，数据显示，自身免疫反应并不受软骨相关成分的束缚，更准确地说，在RP中有多种自身免疫反应发生。进一步探讨了RP发病机制的原因。

2.2蛋白质组学探索自身免疫性疾病中的自身抗原/自身抗体

自身抗原和自身抗体的存在在自身免疫性疾病的发病中起着重要作用，一些自身抗体可作为疾病诊断、治疗和预后的重要标志。然而自身免疫性疾病自身抗原和自身抗体的分类、特点及功能仍不十分清楚。所以研究自身免疫性疾病的自身抗原和自身抗体的目的主要归纳为以下4个方面：第一，发现疾病特异性的自身抗原和自身抗体，提高自身免疫性疾病的诊断率；第二，研究免疫反应的自然发生过程，包括自身免疫、耐受及感染的过程，探讨发病机制；第三，鉴定一种自身抗体作为患者临床分型的根据；第四，发展一种抗原特异性的免疫耐受治疗方法。蛋白质组学成为研究自身免疫性疾病的抗原/抗体系统的理想工具。

蛋白质组学在探索抗原/抗体中主要分为2个系统：其中之一是探索已知抗原的抗体。如抗原或蛋白质的微阵列技术；另一种为探索新的未知抗原的抗原、抗体，如双向电泳/免疫印迹联合质谱技术。

2.2.1自身抗原微阵列

自身抗原微阵列作为研究自身免疫性疾病的有力工具，其优点在于它可以同时分析成千种分子参数，样本范围广，包括血清或其他体液（如脑脊液、滑膜液）。应用荧光或放射标记，质谱，电化学等方法联合检测。Joos等建立了基于微阵列的免疫测定法。在自身免疫性甲状腺炎、类风湿关节炎、系统性血管炎、抗磷脂综合征等自身免疫性疾病中同时分析18种已知抗原，经证明微阵列方法检测抗原更为敏感、更具有特异性。目前临床主要通过检测自身抗体来诊断或鉴别诊断自身免疫性疾病，临床上要求对单个样本进行多种自身抗体谱的检测。Feng等构建了包括SSA 52，SSA 60，SSB和Jo-1等15种自身抗原的蛋白微阵列，检测RA等自身免疫性疾病，且结果与传统方法的结果相似。Hueber等利用一种新颖的抗原微阵列技术–滑液蛋白质微阵列，此微阵列包括225个肽段和蛋白，代表着候选和对照的抗原，用来鉴定RA患者血清中的抗体，证明自身反应性B细胞反应的扩展表位和疾病进展相关，扩展表位可能反应了自身免疫反应的防御措施。应用蛋白质组学分析自身抗体的反应，可以使临床对类风湿关节炎的疾病进程和分型做更明确的诊断。最近,Zhen等建立了一种多重蛋白微阵列来分析系统性红斑狼疮（SLE）患者及SLE小鼠模型血清中的自身抗体，作者推断这种蛋白微阵列是发现新的自身抗体的有利工具。综上所述，自身抗原的微阵列在自身免疫性疾病中的诊断、预后和治疗方面取得了巨大进展。

2.2.2 2-DE/免疫印迹法联合质谱MS

2-DE双向电泳/免疫印迹联合质谱（MS）的方法是探索自身免疫性疾病新的抗原/抗体的理想的工具。2-DE是目前分离复杂蛋白质混合物的最强有力的方法，从很多方面来说，2-DE是最直接寻找和预分离未知蛋白及其翻译后修饰形式的方法。而2-DE正是这种获得蛋白质整体表达情况的工具，同时还可用于展示基因的差异表达情况。2-DE方法与生物质谱技术的不断进步，两者有效的结合，可使研究人员能够更加有效地分离蛋白质复杂混合物，显示蛋白质的差异并随后鉴定差异蛋白。已被证明2-DE双向电泳/免疫印迹联合质谱（MS）的方法是探索自身免疫性疾病新的抗原/抗体的理想的工具，近几年，科学家一一发现了自身免疫性内耳疾病的髓磷脂蛋白过氧化物酶自身抗体、自身免疫性肝炎（AIH）的核不均一型核糖核蛋白抗体A2/B1、类风湿关节炎（RA）的α-磷脂丙酮酸水合酶及瓜氨酸抗体。Thebaul 等应用双向电泳和免疫印迹方法（抗体为一种鼠的抗心磷脂单克隆抗体：mAb4B7）研究白血病细胞系HL-60的蛋白，并通过MS 鉴定了和抗心磷脂单克隆抗体（mAb4B7）起交叉反应的三个蛋白为核仁磷酸蛋白B23、核内不均一核糖核蛋白（hnRNP）A2、60 000 SS-A RNP。结果显示，双向电泳和MS的结合是鉴定单克隆抗体交叉反应性的敏感、有力的技术方法，是进一步鉴定打破SLE 中的B细胞耐受的免疫原性细胞成分的新方法。Saulot 等[20]应用双向电泳和MS 及免疫印迹方法（其所用抗原为重组蛋白）研究255例患有早期关节炎的患者（145例RA患者、70例非RA风湿性疾病患者和40例未定性关节炎患者）的血清，发现抗α-烯醇化酶的自身抗体存在于早期RA患者的血清，此抗体对RA可能具有诊断和预后价值。以上这些研究结果表明，双向电泳/免疫印迹联合MS可以帮我们清楚地认识抗原，鉴定新的抗原/抗体以及进一步评价抗原/抗体致病作用。

2.3 蛋白质组学寻找自身免疫性疾病的标志物

目前寻找自身免疫性疾病的标志物已成为自身免疫病蛋白质组学研究的热点。在自身免疫性疾病发生发展过程中伴有不同的蛋白被表达。通过对正常及病变标本中蛋白质种类和数量的比较分析，可寻找有助于自身免疫性疾病诊断、预测疾病进程、指导临床治疗用药选择、监测治疗效果的特异标志物。对于自身免疫性疾病来说，血清里很可能存在自身抗体，但因为靶抗原还未鉴定出来，这些抗体无法检测。运用蛋白质组学比较自身免疫性疾病患者与健康人或自身免疫性疾病发展阶段组织中或体液中蛋白质在表达、表达水平和修饰状态上的差异，可以发现与自身免疫相关的特异蛋白质。这些自身免疫相关的蛋白质不仅可为自身免疫性疾病发病机制提供线索，而且可作为诊断和治疗的生物标志物。Dotzlaw等通过比较健康人和RA患者的外周血单核细胞的蛋白质双向电泳图谱发现，18种蛋白质在RA患者中表达高于健康人2倍或更多，同时还发现11种蛋白质在健康人（对照组）中表达高于RA患者2倍或更多，这些表达不同的蛋白质经MALDI-TOF-MS法鉴定，其中有一些过去已被显示在RA 的发病机制有潜在的作用。因而认为这样的蛋白质表达图谱的比较可能具有诊断学价值。Xiang等对骨关节炎（OA）和RA血清蛋白质组进行了比较，找到19个仅在 OA 患者血清中存在，而在RA 患者血清中不存在的蛋白质。其中这些蛋白质中的一个被鉴定为磷酸丙糖异构酶（TPI）。因而认为对TPI的自身抗体有可能被用作为OA的诊断标志物。近几年，另外一些高通量的方法，如反向微阵列和SELDI-TOF-MS被认为是敏感性更强而广泛应用于寻找疾病的生物标志物。De Seny等应用SELDI-TOF-MS寻找类风湿性关节炎（RA）的特异血清蛋白标志物，制备103份血清样本（包括RA患者和健康人），比较蛋白质图谱的差异，得到一些标志物的候选峰，再经排除分析筛选到相对分子质量为10832的蛋白质峰是RA患者中表达明显的标志物。另一项关于干燥综合征( SS )的研究，应用相同的技术，在原发性干燥综合征组发现7种标志物表达下降，同时3种标志物表达升高。一些学者应用最新的磁性微球技术与生物质谱联用寻找小肽段水平的生物标志物，在RA、SLE、系统性硬皮病（SSc）中发现许多可用于鉴别诊断的候选生物标志物，而探索这些分子的生物功能目前仍有大量的工作需要继续研究。

蛋白质组学以其深入揭示疾病状态下机体内所有蛋白质表达规律的优势在阐明自身免疫性疾病的特异抗原，抗体和分子机制方面表现出极大的潜力。随着蛋白质组研究技术日趋完善，现行的结构蛋白质组学必然向功能蛋白质组学过渡，为自身免疫性疾病的早期诊断、新药研发以及疾病康复开辟新的思路。

2008-3-24