腹泻病毒三重等温扩增新技术诞生

工作人员在实验室检测

腹泻病（diarrhea diseases）或肠道传染病（enteric infectious disease）是一组多病原、多因素引起的疾病，目前它已成为严重影响人类健康的一个重要公共卫生问题，亚、非、拉地区尤为严重。世界卫生组织（WHO）20世纪90年代的统计结果显示：全世界5岁以下婴幼儿，每年有10亿人患腹泻，可导致500万小儿死亡。在第三世界国家，腹泻病是造成幼儿死亡的第一原因。

疫情肆虐，义不容辞

即使在经济发达的国家和地区，腹泻病也未完全解决，美国、日本等国肠出血性大肠杆菌O157：H7肠炎严重流行，2011年德国暴发的出血性大肠杆菌O104：H4感染和溶血性尿毒综合症（HUS）疫情和2008年初英国诺瓦克病毒疫情的暴发等均可说明这一事实。在中国，腹泻病是仅次于呼吸道疾病的第二位多发病，也是婴幼儿死亡的两大病因之一。我国卫生部早已把腹泻病列为儿科重点防治的疾病之一。

腹泻病分为感染性腹泻和非感染性腹泻两大类，其临床表现轻重不等，多表现为腹痛、腹泻、呕吐、发热等症状，严重者还伴有脱水、电解质紊乱甚至休克、死亡。病毒性腹泻在感染性腹泻中占有重要的比例，轮状病毒（Rotavirus，RV）、诺如病毒（Norovirus，NV）和星状病毒（Astrovirus，AV）等胃肠炎病毒是主要的病原体。它们通过水、食物等途径在儿童和成人中引起急性胃肠炎的散发和暴发，甚至大流行，如2008年初在英国出现的诺瓦克病毒大暴发，每周约有10万人感染该病毒，严重影响人们健康和社会发展。

作为国家质检总局设立的“国家级腹泻病检测重点实验室”，提高腹泻病毒检测水平，创新检测方法一直是实验室研究工作的重要内容。2009年，在珠海市科工贸信局的支持下，实验室莫秋华博士组织专门的课题组，在等温扩增等新型分子生物学检测领域开展腹泻病毒的多重检测技术研究。通过3年的不懈努力，终于突破前人的研究水平，建立了能在一个反应管内同时检测A组轮状病毒（RV）、诺如病毒（NV）和星状病毒（AV）三种病毒的三重实时核酸序列依赖性扩增（Three-multiplex real-time nucleic acid sequence-based amplification，Real-time NASBA）方法。

该方法具有快速、高效、敏感特异和实时检测分析等特点，能广泛应用于临床和口岸卫生检疫和境内疾病控制部门的常规检测和疾病防控。

面对挑战，迎难而上

针对腹泻病毒的检测，目前免疫学的快检方法应用较多，但灵敏度较差，漏检率较高。基于PCR的分子生物学检测方法简便、快速，但灵敏度仍有待提高，而且多重检测稳定性较差。因此，以往的方法仍存在灵敏度低、稳定性差和检测效率低等一系列问题。面对以往的不足，课题组必须找出稳定性更好、检测效率更高的实验方法。本研究建立的方法属于等温扩增技术中的一种，是在NASBA技术基础上发展起来的三重实时NASBA技术。它通过系统分析轮状病毒、诺瓦克病毒、星状病毒等三种病毒的核酸序列及其保守区和变异位点，分别设计和筛选出三组特异性的NASBA扩增引物和分子信标检测探针，三种病毒对应的分子信标探针分别标记上FAM、ROX和HEX三种荧光报告基团，采用实时荧光定量PCR扩增仪进行NASBA等温扩增反应，实现在一个反应管内可以同时快速检测以上三种病毒，整个实时NASBA上机反应时间只需90分钟。为了精益求精，课题组还做了灵敏度的分析，发现此种方法检测病毒的载量灵敏度很高（如图），可以达到个位数量级。

方法学的研究其实是一个繁琐枯燥的工作，它需要反反复复的摸索实验条件，需要不断的重新设计、实验验证，推倒重来、又重新设计，再实验验证。课题组正是在这种反复和重复中坚持了下来，如果没成功，接下来不是逃避，而是继续。3年下来，课题组设计合成的引物探针达到近百条，试剂的组分和配方研制了几十套，阳性样本验证了几百例。功夫不负有心人，大浪淘沙后，最后终于摸索出优选的引物探针和试剂配方，取得了较满意的结果。

累累硕果，获益匪浅

该课题在解决了目前我国口岸卫生检疫工作所需关键技术的同时，通过该课题的实施，使研究团队掌握了国际先进的三重实时NASBA等温扩增技术，提高了口岸疾病监测技术人员在分子生物学领域的专业知识和水平，在研究中通过方法学的设计和优化，积累了很多宝贵的科学经验。课题组负责人莫秋华在研究期间（2010年）被国家质检总局授予“全国质量监督检验检疫‘科技兴检’先进工作者”称号；2010年4月，被珠海市委市政府授予“珠海市先进工作者”称号。

该项目的研究成果已申请3项国家发明专利，另有研究成果转化为1项检验检疫行业标准。研究成果还可以产业化成为商品化的试剂盒，通过与生物科技公司的合作方式开发成腹泻病毒新型多联分子检测试剂盒，有利于传染病防控部门开展疾病监测工作。本研究建立的方法对于防止急性胃肠炎的暴发、大流行，保障人民健康，做好公共卫生工作都具有重要意义。此外，开展创新性的、有自主知识产权的病原体快速检测方法研究，对于推动方法学的理论发展、改善我国对国外诊断试剂的过度依赖、减少医疗检测成本、创造更大的经济效益和社会效益也有十分重要的战略意义。

链 接

鉴定会上，鉴定委员会专家听取了课题组的项目工作报告和研究报告，审核了全部技术资料、科技查新报告及验证和应用报告，并进行了质询，经评议后一致认为，课题组研究建立的腹泻病毒三重实时核酸序列依赖性等温扩增（Real-time NASBA）技术快速、高效、敏感特异，该成果在腹泻病毒的临床检测和监测工作中具有较好的应用价值，建议加快成果转化和产业化进程。《中国国门时报》